Como biólogos ler um gene com sequenciação de adn
A sequenciação de ADN,
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Depois de saber a ordem dos nucleidos em ambas as versões de um gene, que pode identificar qual as alterações no gene causa a doença.
sequenciamento de DNA depende de um tipo especial de nucleotídeos, chamado ddNTP (abreviação de trifosfato dideoxyribonucleotide). ddNTPs são um pouco semelhantes aos nucleotídeos do DNA regulares, mas eles são diferentes o suficiente para que eles param de replicação do DNA.
Quando um ddNTP é adicionado a uma cadeia crescente de ADN, polimerase de ADN não é possível adicionar mais nucleidos de modo que a cadeia em crescimento pára nesse ponto. A sequenciação de ADN utiliza esta interrupção da cadeia para determinar a ordem de nucleótidos em uma cadeia de ADN.
A maioria sequenciamento de DNA feito hoje é sequenciação de ciclo (Mostrado na figura), um processo que funciona como PCR, para criar muitas cópias do gene a ser sequenciado. Mas, ao contrário de PCR, os ddNTPs, bem como nucleotídeos regulares são adicionados à mistura. Assim, como a DNA polimerase trabalha fora fazendo muitas cópias do gene, a cada momento e, em seguida, ele agarra um ddNTP (mostrado como rectângulos brancos) em vez de um nucleótido normal (mostrado como rectângulos pretos).
Depois de um ddNTP é adicionado a uma molécula de ADN em crescimento, a replicação é parado. O resultado final do ciclo de sequenciação é muitas cópias parciais do gene a ser sequenciadas, todos os quais são interrompidas em pontos diferentes e que se encontram, por conseguinte, diferentes comprimentos.
Depois das cópias parciais são feitos, os cientistas carregá-los em uma máquina que utiliza a electroforese em gel para colocar os exemplares em ordem por tamanho. Como as sequências parciais passar através da máquina, um laser lê uma etiqueta fluorescente em cada ddNTP, que revela a fim de nucleótidos no gene.
Teste a sua compreensão de leitura ddNTP com estas questões práticas:
Um cientista quer para determinar a sequência de um gene associado a uma doença genética. Ela leva amostras de DNA de uma pessoa que tem a versão causador de doença do gene-las em quatro tubos separados de teste, cada uma contendo nucleidos, ADN-polimerase, e iniciadores.
Em seguida, em cada tubo, ela adiciona um tipo de didesoxinucleótido - ddATP, ddGTP, ddCTP, ou ddTTP - de modo a que cada tubo irá produzir fragmentos de ADN que terminam com um nucleótido particular (A, G, C, ou T). Depois de executar as reacções de sequenciação, ela carrega os resultados de cada tubo para um gel e separa os fragmentos usando electroforese em gel.
Com base nos resultados em sua gel, mostrado nesta figura, o que representa a sequência do gene?
Uma jovem cuja mãe morreu de início precoce de Alzheimer quer saber se ela está em risco de desenvolver a doença. A doença é causada por um alelo dominante, por isso, se a mulher tem apenas uma única cópia do alelo causadores de doenças, ela vai desenvolver a doença.
Descrever como um cientista poderia usar uma amostra de sangue do jovem para a tela dela para a presença do alelo causadores de doenças. Certifique-se de incluir todas as técnicas necessárias, começando com a amostra de sangue.
A seguir estão as respostas para as questões práticas.
ADN desloca em direcção ao eléctrodo positivo em um gel, e os fragmentos mais pequenos mover a maior distância, de modo que as bandas no gel que estão mais próximos do + são os menores bandas.
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O fragmento mais curto (a banda mais baixa) é na faixa que foi carregado com ddCTPs, de modo que o primeiro nucleótido na cadeia de ADN deve ser C. O seguinte é banda na pista que foi carregado com ddTTPs, de modo que o lado de nucleótidos devem ser t .
A próxima banda está novamente na pista C, então o próximo nucleotídeo deve ser um C. Se você continuar lendo o gel do lado do + para o lado - - em outras palavras, de baixo para cima - você pode descobrir o resto da sequência de ADN. A sequência inteira é CTC AGC CAT AGG.
O cientista iria extrair DNA a partir da amostra de sangue e, em seguida, usar quer sequenciação de DNA ou enzimas de restrição para determinar se o jovem transporta o alelo causador da doença.
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DNA método de sequenciamento: O cientista lê as seqüências de alelos da jovem e compara-os com as sequências conhecidas dos alelos normais e patológicos. O cientista separa amostra de DNA da jovem e coloca-lo em quatro tubos. Cada tubo contém iniciadores para o gene de Alzheimer e lotes de nucleótidos.
Um de cada tubo contenha um ddNTP marcado fluorescentemente diferentes: uma com ddATP, um com ddCTP, ddGTP com um, e uma com ddTTP. O cientista coloca os tubos em um sequenciador ciclo, onde eles passam por muitas rodadas de replicação do DNA.
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Em seguida, o cientista executa as amostras através de um gel que os separa por tamanho. O computador detecta o sinal fluorescente no final de cada pedaço de DNA do menor ao maior e usa-lo para reconstruir as seqüências de DNA para os alelos da jovem.
Restrição método enzimático: O cientista usa PCR no ADN do sangue para fazer muitas cópias do gene associado com a doença de Alzheimer. Em seguida, o cientista utiliza uma enzima de restrição que é conhecido para cortar de forma diferente dentro das formas normais e de doença do gene.
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O cientista corta amostra de ADN da jovem com a enzima de restrição e, em seguida, separa o ADN utilizando electroforese em gel. O cientista compara os tamanhos dos fragmentos de DNA produzidos por DNA da jovem com o padrão conhecido gerada pelos alelos normais e patológicos.